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      透射電鏡生物樣品取材基本要求

      2020-04-25 18:21 檢測知識

        以下是關于在日常在生物透射實驗中關于生物樣品取材固定運輸的一些說明,供生準備做物透射電鏡的各位研究人員參考!
        1. 取材準備

        1) 試劑    所需新鮮的2.5%戊二醛(最好是進口固定劑,國產效果一般,需要現配現用)、0.1M PH7.35 的磷酸鹽緩沖液,注明配制日期及啟用日期,置于4-6攝氏度冰箱預冷(2.5%戊二醛預冷至少 1 小時以上;磷酸鹽緩沖液不宜長時間預冷,容易結晶)。

        2) 儀器與器材    鋒利刀片(手術刀片或飛鷹雙面刀片)、鑷子、低溫操作臺、1.5mlEP管、培養皿(或者硬紙卡,盛戊二醛用)、注射器(植物組織用)、冷凍離心機(細菌、細胞、藻類等需要離心的樣品使用)。

        2. 取材要求

        1) 快

        取材動作要迅速,材料離體后 1min 鐘內必須進入戊二醛固定液,使組織、細胞盡可能保持原來生活狀態,解剖器械要用鋒利的刀片(新的手術刀片或飛鷹雙面刀片)劃切,避免牽拉或擠壓,盡量減少取材中的機械損傷。(動物處死后 5min 內完成此步驟,時間越短越好!)

        2) 準(取材要準確

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       ?、诓课灰獪蚀_:如觀察腎臟腎小球或腦神經元需取皮質而不要取髓質,

        觀察胰島盡量取胰尾。

       ?、畚改c道、皮膚、角膜、視網膜、耳蝸、骨骼肌等要注意方向性(橫切或縱切),取材成條狀(0.5mm×1mm×3mm),確保要觀察的部位在較長的切面上。

        3) 冷

        取材過程應在 0~4 攝氏度的操作臺上操作(或者是冰上操作,但要注意切勿使組織直接接觸或貼近冰面,需要以操作面板隔離,以免操作時間過長而造成組織結冰出現冰晶損傷),所有器械、容器、2.5%戊二醛、PBS 需 4℃預冷足夠長的時間。

        4) 小

        不定位組織大小為 1mm×1mm×1mm(盡可能小,可以更小為 0.5mm×0.5mm×1mm,越薄越好),如肝、肺、脾等不需要看特定結構的非定位器官組織;定位組織如神經、骨骼肌、腎、腦、腸、血管、胰島等組織取材大小為 0.5mm×1mm×3mm的長條狀(越薄越好)。

        生物器官組織取材

        1. 浸入固定 麻醉(1%戊巴比妥鈉銨 5ml/kg 體重腹腔注射)或斷頭急性處死,解剖出所需器官,用解剖刀(鋒利刀片)取一小塊組織,立即(越快越好,1~3min 完成此操作)放入盛有預冷 2.5%戊二醛的培養皿(或硬紙片上)中,隨后立即沿小塊組織邊緣(已經被固定)用鋒利刀片取 1mm×1mm×1mm 或 0.5mm×1mm×3mm 大小組織置于盛有預冷 2.5%戊二醛 1.5mlEP 管中繼續固定,4℃保存(請勿靠近冰箱邊上造成標本冷凍結冰!!!)。

        2. 灌注固定 腦組織等(初次取材者或未常規做灌注固定者此方法慎用,因在 TEM 結果出來前無法評價其固定是否成功)。

        培養細胞取材

        1. 貼壁細胞 培養好的細胞不經漂洗直接倒出培養液后迅速加足量預冷 2.5%戊二醛固定1h(戊二醛完全浸沒細胞),隨后用細胞鏟或細胞刮成 45°傾角快速鏟下細胞(勿用胰蛋白酶消化)后全部轉移到 15~50ml 離心管內,轉速 500~800rpm 離心 5min 成團(細胞團大小約半個至一個綠豆大小為宜),隨后去除大部分上清液(留 1ml 左右,切勿丟失細胞),將離心管里的細胞輕輕吹散后轉移到 1.5ml 的 EP 管內,垂直靜置自然沉降 1h 后輕輕吸去上清液(切勿丟失細胞),再沿管壁緩緩加入 1ml 新預冷 2.5%戊二醛,隨后置于 4℃冰箱固定保存。(此過程操作輕柔,切勿損傷細胞!)

        2. 懸浮細胞 直接將細胞培養液全部轉移到 15~50ml 離心管內,轉速 500~800rpm 離心5min 成團(細胞團大小約半個至一個綠豆大小為宜),隨后去除大部分上清液(留 1ml 左右,切勿丟失細胞),將離心管里的細胞輕輕吹散后轉移到 1.5ml 的 EP 管內,垂直靜置自然沉降 1h 后輕輕吸去上清液(切勿丟失細胞),再沿管壁緩緩加入 1ml 新預冷 2.5%戊二醛,隨后置于 4℃冰箱固定保存。(此過程操作輕柔,切勿損傷細胞!)

        3. 細菌懸液(固體培養基自行轉移成懸浮液) 直接將細菌懸液全部轉移到 15~50ml 離心管內,轉速800~1000rpm 離心 5min 成團(細胞團大小約半個至一個綠豆大小為宜),隨后去除大部分上清液(留 1ml 左右,切勿丟失細菌),將離心管里的細菌輕輕吹散后轉移到 1.5ml 的 EP 管內,垂直靜置自然沉降 1h 后輕輕吸去上清液(切勿丟失細菌),再沿管壁緩緩加入 1ml 新預冷 2.5%戊二醛,隨后置于 4℃冰箱固定保存。(此過程操作輕柔,切勿損傷細菌!)

        植物組織取材

        植物取材較容易,取一小塊植物組織浸入盛有預冷 2.5%戊二醛培養皿(或硬紙卡)上,隨后用鋒利刀片切成 0.5mm×0.5mm×3mm 小長條薄片,隨后抽取氣體。抽取氣體 將植物組織同固定液一起倒入注射器,用乳膠手套食指堵住注射器出口,右手拉動針栓,將注射器口垂直向上,松開食指,右手輕推針栓使液面上的氣泡從注射器口排出,反復多次,直至組織沉入固定液。
        最后戊二醛固定液必須充滿整個試管,不能留出較大氣泡在里面,會導致部分組織暴露在固定液外面,影響最終的測試結果。

        透射電鏡生物樣品運輸基本要求

        用封口膜將 1.5mlEP 試劑管蓋再次封好(務必認真操作,經常發生郵寄過程中固定液灑漏導致整個樣品全廢),做好標記,填好送樣申請單(必須填,隨樣品寄出紙質版申請單)。隨后用密封袋密封好插在海綿板或可以減震的塑料上,用廢舊報紙包裹,放入 1~2 個冰袋,樣品盡可能遠離冰袋固定放置,或者用棉花將試管包裹起來,以防樣品出現冰晶損傷,聯系京東順豐等快遞寄出。
        實驗案例欣賞

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